近日，华南师范大学华南先进光电子研究院詹求强教授团队在三维超分辨荧光显微成像领域取得重要创新性成果。他们成功克服传统共聚焦显微术三维成像分辨率很低且各向异性的原理性缺陷，提出新颖的“自干涉场激发非线性成像”技术。

该技术以极其简单的光学配置和低成本激光器，实现了超低光强（19 kW cm^-2）激发下纳米探针三维分辨率均衡（＜60 nm）的超分辨成像，极大地提升了三维超分辨成像性能，并成功应用于三维亚细胞结构的特异性标记观测。相关成果于2024年9月18日以“Sub-60-nm isotropic 3D super-resolution microscopy through self-interference field excitation”为题发表在光学领域权威期刊Optica上。

激光共聚焦显微镜具有三维成像能力，已被广泛应用科学研究中。然而，受光学衍射极限效应，传统共聚焦显微镜的横向分辨率~200 nm，轴向分辨率~500 nm。这种分辨率的不均衡性导致了共聚焦显微镜在三维成像时难以实现精细的结构表征，特别是在轴向方向上，成像模糊和精度不足的问题更加突出，严重阻碍了显微成像技术的进步。超分辨荧光显微成像技术的出现突破了光学衍射极限的桎梏，使研究人员得以用更高的分辨率窥探纳米尺度的微观世界。然而，目前大部分超分辨技术主要集中在如何提升横向分辨率，对提升轴向分辨率的相对较少，使得三维分辨率依旧长期面临不均衡的窘境，限制了超分辨光学显微镜的进一步发展。事实上，仅仅单方面地提高横向分辨率或轴向分辨率都会存在局限性，三维全尺度均衡超分辨成像才是研究者最终的目标。

针对上述前沿科学难题和重大技术发展需求，詹求强教授团队以发展全新三维超分辨显微术作为切入点，基于团队在多光子荧光超分辨显微术领域的前期基础上，提出了新理论并通过实验证实了SIEx的成像原理，巧妙引入了银反射镜这一简易的光学组件产生了显著的单光束自干涉效应，首次实现了镜面自干涉场对成像点扩散函数（PSF）三维光场的各向同性压缩，以纯物理的方法实现三维分辨率均衡的亚60 nm显微成像，该技术兼具分辨率三维均衡和低功率激发高分辨率两大优势的全新超分辨技术。不需要复杂的光学配置和重建算法，SIEx几乎可以与目前所有的远场超分辨显微术结合。

在SIEx方法中，当银反射镜被放置在成像焦平面时，激发PSF被分隔为两部分：未抵达镜面入射光斑保持经由高数值孔径物镜紧聚焦后的初始相位，而抵达镜面的反射光斑将与其产生显著的干涉，并产生固定的相位差。经物镜轴向扫描形成稳定三维均衡的自干涉光场（图1）。为了进一步探究SIEx的应用潜力，该团队构筑了具有超高阶光学非线性的荧光探针，其非线性响应可达到33阶。理论证明，自干涉光斑受益于非线性效应，在横向与轴向分辨率均突破60 nm（图1）。

基于上述理论，该团队利用一套极其简单的单束激光扫描成像系统，对光子雪崩纳米探针进行成像，最终实现了横向分辨率为54 nm，轴向分辨率为57 nm的三维各向同性超分辨成像。相较于传统多光束3D-STED技术高达GW/cm²量级的激发功率，SIEx激发功率密度仅19 kW cm^-2，且仅需单光束，为三维超分辨率成像研究大大降低了成像成本。进一步地，该团队将光子雪崩探针免疫标记亚细胞结构，证明了SIEx的生物成像能力，清楚解析了细胞的精细结构。该成果提出的自干涉场激发非线性成像技术是纯物理直接超分辨的方法，因此在突破衍射极限的光传感、光存储、光刻加工、3D打印以及纳米激光等前沿领域均有应用前景。

华南师范大学为论文的独立完成单位和通讯单位，华南先进光电子研究院研究生刘畅、潘彬雄为论文的共同第一作者，詹求强教授为项目负责人和论文通讯作者。参与工作的还有王保举副研究员、赵琪、倪阅等其他团队成员，光电科学与工程学院陈同生教授及其团队成员参与合作。该项目得到了国家自然科学基金重点项目、国家优青项目以及广东省基础与应用基础研究基金、中国博士后科学基金等项目经费的支持。

论文全文链接：https://doi.org/10.1364/OPTICA.530893