华师生科院周小明课题组在核酸检测技术发展上取得新进展
来源:生命科学学院|作者:其他|摄影:蔡臻臻 其他|编辑:卢嘉裕
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4月4日,生命科学学院周小明研究员课题组在国际知名期刊德国应用化学《Angew. Chem. Int. Ed.》在线发表了题为“Light-Start CRISPR‒Cas12a Reaction with Caged crRNA Enables Rapid and Sensitive Nucleic Acid Detection”的研究论文。作者基于光化学活化的笼式crRNA开发了一种新型的光启动CRISPR-Cas12a系统,并与重组酶聚合酶等温扩增(RPA)结合,实现了快速、灵敏的光控一管式检测,解决了CRISPR分子诊断技术应用的一个关键瓶颈问题。

CRISPR技术被认为是近三十年来最重要的生物技术突破之一。由于CRISPR系统特异的靶标识别机制、高效的反式裂解活性和多样化的温度反应条件,被认为是开发核酸POCT检测的理想工具。在当前的研究进程中,将CRISPR识别和核酸等温扩增结合是最接近商业化使用的分子诊断方案。然而,因为CRISPR切割会破坏核酸等温扩增的模板,使得二者在单管、单步的检测中难以兼容。而分步的检测方案不但操作繁琐而且容易引发气溶胶假阳性风险。因此,发展高效、闭管的CRISPR检测方法是解决其商业化应用的一个关键。当前国际上多个课题组对该问题进行攻关但是仍缺乏理想的解决方案。

周小明研究员课题组在去年曾提出了光控CRISPR分子诊断概念(PNAS, 2022, 119, e2202034119)来解决这个问题。通过设计一种修饰了光可切割连接子(PC-linker)的沉默寡核苷酸与crRNA杂交,阻断CRISPR系统的识别和切割功能。当核酸扩增完成后用UV光照射导致沉默寡核苷酸断裂从而CRISPR切割活性恢复。光控一管法在时间维度上分离了核酸扩增和CRISPR反应,实现了封闭、单管、高灵敏度的核酸检测。尽管光控CRISPR诊断技术的应用前景广阔,但现有的光控版本仍存在应用问题。例如,该方法需要优化沉默寡核苷酸和crRNA的比例,以实现crRNA的完全杂交和沉默。这一额外的杂交步骤使检测过程和未来冻干试剂的构建变得复杂。此外,基于crRNA杂交的沉默策略将阻止crRNA与Cas蛋白的预先结合,从而影响Cas蛋白/crRNA的稳定性。因此,迫切需要开发一种更直接的光控CRISPR检测方法,以实现更简化的核酸检测。

近日,该课题组通过合成6-硝基哌啶氧基甲基(NPOM)修饰的CRISPR-Cas12a crRNA,开发了一种新型的光启动CRISPR-Cas12系统。在这一技术中,NPOM笼化的crRNA可阻止crRNA与靶DNA之间的沃森-克里克碱基配对,从而沉默CRISPR-Cas12活性。通过UV光诱导crRNA的脱笼化即可实现快速的活性恢复。与之前的光控CRISPR检测方法相比,当前的光启动策略有助于开发更加稳健的一管式CRISPR检测方法,具有更简单(使用与常规CRISPR检测相同的试剂制备流程)、更快(无需RNA杂交步骤)、更稳定(笼化crRNA不影响其与Cas12a的预先结合,从而提高试剂的稳定性)和更低成本(只需要一条笼化crRNA)的特点。在对人类疱疹病毒EBV DNA样本和SARS-CoV-2 RNA样本的分析中,本研究方法展现出极快的检测速度(10-20分钟可完成低浓度临床样本检测),这表明该方法在应用上的巨大潜力。此外,该团队还研发了便携式、自动化光控CRISPR检测装置,实现具有自有知识产权的检测方法、试剂、和仪器全系列开发。这一进展将有望加速推进CRISPR分子诊断技术在生物医学、农业和食品安全等领域的广泛应用。

周小明研究员团队基于多学科背景,以交叉技术的角度,聚焦于研究“定性和定量核酸检测新方法及其在重大疾病核酸标志物、病原微生物的检测应用”。近年来,该研究团队在核酸检测技术研究上取得了系列重要进展。包括发明了免核酸扩增的单分子定量检测技术(ACS Nano 2021, Nano Letters 2021)、开发了超快胶体金-核酸标记技术和CRISPR核酸试纸条(ACS Nano 2020, JACS 2020, Angewadte Chemie 2021, Nature Comm 2022)、实现一管法CRISPR核酸检测(PNAS 2022, Anal Chem 2022)、构建了电化学发光核酸探针和检测平台(Nature Protocols 2014)等。基于这些工作影响,2021年周小明研究员受《Annual Review of Analytical Chemistry》编辑邀请就这一主题撰写综述研究论文,编辑在来信中曾评价:“Although, I have not met you in person, I am a big fan of your contributions and leadership in this field”。 2023年4月5日,题为CRISPR-Based Biosensing Strategies: Technical Development and Application Prospects的评述论文公开发表,作者就CRISPR生物传感策略的技术发展历程进行总结并就将来的方向提出展望。

以上工作由华南师范大学生命科学学院博士研究生胡梦露,硕士研究生刘儒汗,硕博连读研究生田甜等联合完成,周小明研究员为通讯作者。工作得到了湖北省疾控、中山大学肿瘤防治中心等合作单位的大力协助。该系列工作受到了国家自然科学基金“未来生物技术”原创探索项目、国家自然科学基金重大研究计划、面上项目、国家级人才项目、湖北省重点研发计划等基金项目资助。

论文原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202300663

https://doi.org/10.1146/annurev-anchem-090822-014725

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