近日，我校华南先进光电子研究院光及电磁波研究中心詹求强教授课题组在非线性荧光损耗机理及超分辨荧光显微成像领域取得突破性进展：在荧光损耗物理机理上，提出了受激辐射诱导激发损耗新机理，“拔本塞源”式对敏化能级进行损耗，从源头阻断荧光的激发能量，新机理带来的“荧光损耗放大效应”大幅降低了超分辨所需要的激光光强，在低光强条件下实现了9种不同光谱探针的荧光损耗。在超分辨成像技术上，由此发展了一种通用性强的基于单对低光强、近红外、连续波激光的多色超分辨显微成像技术，克服了传统多色STED超分辨系统所依赖的多对超快脉冲光束协同工作的复杂系统、高成本、低稳定性等问题。该成果于北京时间5月23日以“Achieving low-power single-wavelength-pair nanoscopy with NIR-II continuous-wave laser for multi-chromatic probes”为题在Nature子刊《Nature Communications》在线发表。
受激发射损耗（Stimulated emission depletion, STED）超分辨显微镜的概念由德国科学家Stefan W. Hell于1994年提出，该技术于2014年获得了诺贝尔奖。STED超分辨技术的原理是在激光共聚焦显微镜系统的基础上，额外引入一束空心环形激光光束，通过受激发射损耗荧光探针的激发态电子，将激发光斑外围的荧光信号损耗掉，从而压缩有效荧光点扩散函数，突破衍射极限提高分辨率。与其他超分辨成像技术相比，STED具有光学切片、无需计算重构、可实时成像等优点，是一种纯物理法的超分辨荧光成像技术。然而，传统STED显微镜存在原理性局限和问题：受激辐射作用如果要在与自发辐射（寿命有机染料通常为纳秒级）竞争中占主导，通常需要高功率的超短脉冲（飞秒/皮秒）激光作为损耗激光，这往往会导致严重的光漂白、光毒性和重激发背景等问题。此外，激发/损耗光的波段需要根据不同荧光探针的光谱特性进行选择，为了匹配多色探针的应用和多色超分辨成像的需求，每更换（增加）一种不同颜色的探针STED系统就要更换（增加）一对激光器的波长，超分辨成像需要对多对激光进行高精度三维空间xyz重合（纳米级）、精准的脉冲时延同步控制（纳秒级），这会导致超分辨技术和系统复杂度高、成本高、维护难。此外，这种情况下荧光探针之间的光谱重叠也会导致荧光检测通道之间的信号串扰。针对上述关键问题和重要需求，詹求强教授自2017年起带领研究生探索新机理，最终以STED原理性缺陷为突破口，提出全新机理解决了关键问题。
上转换荧光纳米颗粒是一种纳米荧光探针，具有近红外激发、反斯托克斯位移大、无背景荧光、发光极其稳定等独特优势。上转换纳米探针通常是一个敏化-发光二元系统，敏化离子负责吸收激发光能量，然后传递给发光离子辐射波长更短的荧光。为解决STED面临的上述难题，詹求强课题组基于上转换荧光技术提出了全新的思路：抑制敏化离子和发光离子间的能量传递过程就可以切断对发光离子的能量补给，让发光离子“无光可发”，即受激辐射诱导激发损耗机理（Stimulated-emission induced excitation depletion, STExD）。结合上转换发光的多光子非线性泵浦依赖特性（非线性效应随泵浦的光子数增多而不断增强），实现了光子数越高的荧光能级电子损耗越强烈，STExD机理具有传统STED所不具有的对荧光损耗进行非线性放大的独特效应，与之伴随的技术意义就是可以逐级降低高能级荧光损耗所需要的饱和光强，这突破了传统STED中的饱和光强理论的限制（实验值明显低于传统理论值）。基于此，研究团队使用740 nm的激发光和1064 nm的损耗光，在钕掺杂的上转换荧光探针中实现了高达99.3%的超高损耗效率，损耗饱和光强降低至23.8 kW/cm2，比传统STED探针降低了3个数量级。结合上转换发光一对多的敏化-发光特性，STExD可以实现一对激光实现对多种UCNPs探针的光开关控制。钕离子是上转换发光常用的敏化离子，可以单独或与镱离子联合敏化多种发光离子，研究团队利用镱离子的能量传递桥梁作用，仅使用一组固定波长的激光器就成功实现了铒离子，钬离子的高效荧光损耗，损耗效率分别超过90%和80%。进一步地，也分别在镨、铕、铥、铽掺杂的体系中实现了高效的荧光损耗效应，总计实现9种不同光谱探针的同时荧光损耗。
以此新机理STExD为基础，课题组发展了一种基于单对低光强、近红外、连续波激光的多色超分辨显微成像技术，分别对钕（黄色），铒（红色），钬（绿色）掺杂的上转换荧光探针实现了不同颜色的超分辨成像，原始图像分辨率达34 nm，并进一步实现了钕、钬掺杂的上转换荧光双色超分辨成像。通过荧光探针的表面改性和特异性修饰，课题组成功将上转换荧光探针免疫标记到HeLa癌细胞的肌动蛋白纤维，实现了亚细胞结构的超分辨生物成像。该工作提出的STExD通用发光损耗策略巧妙地利用了上转换荧光的传能发光特性，为解决传统STED技术的问题、开发新型探针提供了新的方案，为开发低光毒性、深层组织（近红外II区损耗激光）的多色超分辨成像技术奠定了基础，在突破衍射极限的光传感、光遗传学、光刻等前沿领域也具有广泛的应用前景。
我校2017级硕士研究生郭鑫、蒲锐（现均为博士研究生）为论文的共同第一作者，课题组2016级黄冰如、2015级吴秋生等硕士生对该课题的实验做出了重要贡献，詹求强教授为论文的独立通讯作者，华南师范大学为第一署名单位。参与工作的还有课题组其他研究生，同时来自瑞典皇家理工学院（KTH）Jerker Widengren教授、刘海春博士等长期合作者对课题进行了重要讨论和指导。
该研究得到了国家优秀青年科学基金项目、广东省杰出青年科学基金、国家自然科学基金面上项目等经费的支持。
论文链接：https://rdcu.be/cN8qo 或
https://www.nature.com/articles/s41467-022-30114-z
参考阅读：近日詹求强教授课题组在《Nature Nanotechnology》发表重要研究成果
https://news.scnu.edu.cn/50299
作者/通讯员:郭鑫 詹求强 | 来源:华南先进光电子研究院 | 编辑:杨柳青
